Рестрикциялау — модификациялау құбылысы 50-ші жылдары байқалған болатын. Рестрикция тоқтату деген мағынаны білдіреді, ал модификация — молекуланың белгілі топтарын химиялық жолмен немесе оларға баска топтарды жалғау арқылы өзгерту. Рестрикция мен модификациялау құпиясын В. Арбер ашты.
Бактерияның «өзінің» нуклеин кышқылын «бөтен» фагтардың (вирустардың) нуклеин қышқылынан ажырататын арнайы ферменттері болады. Рестрикция ферменттері фагтың нуклеин қышқылын үзіп, оның клеткада көбеюіне жол бермейді. Рестриктазалармен қатар бактерияларда метилаза деген фермент бар. Ол бактерияның өзінің ДНҚ тізбегіндегі азоттық негіздерге белгілі мөлшерде әрбір репликациядан кейін метил тобын (СН3) жалғап, модификациялап отырады. Метилденген ДНҚ-ны рестриктаза «өзінікі» санап оған «тиіспейді». Бұл бактериялардағы өзіндік бір «иммундык жүйе» іспеттес. Дегенмен, кейде бактерия клеткасына енген фагтың кейбір нуклеин қышқылы кездейсоқ метилденіп кетеді. Осы қателігінен бактерияның өзі фагтың әсерінен қырылып калады. Осы құбылысты О. Смит, Д. Натанс және В. Арбер ашты. Рестриктазалар табиғаттың ген инженериясына арнап жасаған таптырмас құралы. Бактерия әр түрлі болғандықтан олардың рестриктазалары ДНҚ-ны әртүрлі жолмен үзеді.[Қазір 500-ден аса рестриктаза түрі белгілі және олар ДНҚ-ны бір-бірінен өзгеше 120 жерінен үзе алады. Яғни зерттеуші рестриктазаны тандай отырып ДНҚ-дан қалаған ферментті нсмесе генді бүлдірмей бүтін күйінде кесіп алады.
Генді бөліп алу мен ген өркенін (клондарын) алу үшін әртүрлі объектілер (бактериялардан, сүтқоректілер клеткаларынан, құстардан т. б. алынған) және әртүрлі вирустар жұқтырылган ортада өсірілетін ерекше ферменттер құрал ретінде пайдаланылады. Негізіндс олар үш түрлі ферменттер: рестриктазалар, лигаза жәис кері транскриптаза.
Рестриктазалар — дезоксирибонуклеазалардың ДНҚ молекуласын қысқа немесе ұзын болшектерге тіпті жеке нуклеотидтерге дейін кесетін ферменттердің бір түрі. Рестриктазалардың ерскшеліктері ДНҚ молекуласын кез кслген жерден кеспей тек белгілі нуклеотидтер арасынан кесуінде. Әрбір рестриктазаның тандайтын нуклеотидтср орналасу тәртібі бар. Бұл әдетте 4-6 жұп нуклеотидтер, әртүрлі рестриктазалар үзетін жеріндегі нуклеотидтердің құрамында айырмашылығы болады. Мысалы Е. соІі рестриктазасы ДНҚ молекуласын ГААТТЦ учаскесіндс үзеді, Ват -НІ-ГГАТЦЦ учаскесінде. Қазір әр түрлі рестрикта-залардың жүзден артық өзіндік бірізділігі белгілі.
ДНК тізбегінің ұзына бойында нуклеотидтер кездейсоқ орналасса, теөт белгілі нуклеотидтен тұратын жүйелілік (бірізділік) 1/256-ға, ал алты нуклеотидтен — 1/4096 тең болады. Сондықтан рестриктазалар ДНК-ны бірнеше жүздеген немесе мындаған нуклеотидтер жұптарынан түратын бөлшектерге үзеді,
Лигаза — ДНҚ-ның бос ұштарын бір-біріне жалғайтын фермент. Бұл фермент қалыпты клеткаларда ДНҚ синтезіне және репарация (қалпына келу) процестеріне қатысады, яғни ДНҚ молекуласының біраз бүлінген жерлерін қалпына келтіруге қатысады.
Кері транскриптаза — ДНҚ-полимераза тәріздес фермент. Бірақ ДНҚ-ны ДНҚ-дан емес РНҚ-дан синтездейді. РНҚ-полимеразамен салыстырғанда ол кері бағытта жүмыс істейді, яғни ДНҚ-дан РНҚ-ға емес, РНҚ-дан ДНҚ-ға. Кері транскриптаза ферментінің қалыпты сау клеткалары бар ма, және оларда ДНҚ синтезі РНҚ-да жүре ме? Бұл күмәнді сүрақ әлі толық шешілмеген. Алайда бұл фермент, эукариоттар клеткаларында оларға ДНҚ арқылы көбейетін РНҚ-сы бар вирустарды жұқтырғаннан кейін пайда болады. Бұл вирустардың геномы кері транскриптазаны кодтайды, соның көмегімен ви-рустың ДНҚ-үлгісі құрылады да, кейін вирустар молекулала-ының РНҚ-сы синтезделеді.
ДНҚ РЕКОМБИНАНТТАРЫ (БУДАН ДНҚЛАР)
Генетикалық рекомбинацияның мәні — екі хромосоманың өзара гендерімен алмасуында. Екі немесе одан көп тұкым қуатын анықтауышы бар клетканың немесе организмнің пайда болуына әкеп соғатын кез келген процесті 1958 жылы Понтекорво рекомбинация деп атады. Міндетті түрде сүтқоректілердің жыныс клеткалары пайда болғанда, мейоздың барысында гомологты хромосомалар гендсрімен алмасады (кроссинговер — айқасу кұбылысы). Осы алмасулар ұрпақтарға берілетін тұқым қуатын белгілердің араласуын түсіндіруге мүмкіндік бсреді.
Гендер алмасуын, сондай-ақ клеткаға «бөтен» геиді енгізуді генетикалық рекомбинация арқылы in vitro — организмнен тыс жасауға болады.
1972 жылы П. Бергтің лабораториясында (АҚШ, Станфорд университеті) ең бірінші рекомбинантты деп аталатын будан ДНҚ молекуласы алынды. Оның құрамына лямбда (X) бактериофагының геномы мен 5″ К40 вирус геномы кірді.
Организмнен тыс рекомбинация әдісі, ор түрдің ДНҚ-ларын (табиғи немесе жасанды) бөліп алып, оларды бір-бірімен қосуды, содан кейін осы рекомбинантты ДНҚ-ны тірі клеткаға енгізіп, жаңа белгінің пайда болуын мысалы, ерекше белок синтезін жүргізуді көздейді
Мұндай эксперименттердің мақсаты ДНҚ-дағы белгілі бір нуклеотидтер жүйелілігін «векторға» енгізіп, кейін клетканың ішінде жұмыс істеткізу. ДНҚ фрагментін вектормен жалғастыру төмендегідей жолдармен жүргізіледі:
1) ректрикциялық эндонуклеазалардың қатысуымен пайда болған ДНҚ-ның жабысқақ ұштары арқылы;
2) ДНҚ-ның әрбір тізбегіне косымша полинуклеотидтер фрагменттерін синтездеу (поли-А, поли-Т);
3) Т4-лигаза ферментінің көмегімен тұқыл ұштарын жалғау. 1974 жылдан бастап рекомбинантты ДНҚ алу жұмыстары көптеп жүргізілді.
Кері транскриптазаньщ көмегімен иРНҚ молекуласында ДНҚ тізбегі синтезделеді (кДНҚ), содан кейін иРНҚ сілтінің көмегімен алынып тасталады да ДНҚ-полимеразанын, көмегімен ДНҚ-ның екінші тізбегі құрылады. Экзонуклеаза ферментімен ДНҚ-ның екі тізбегі де кысқартылып, ұштық трансфераза арқылы олардың ұштарына поли-Т жүйелілігі тігіледі. Векторлық плазмиданың сақина ДНҚ-сын рестриктазамен кесіп желі (сызық) түріне келтіреді, содан кейін экзонуклеазамен қысқартып, ұштық трансферазамен поли-А жүйесін тігеді. Ең ақырғы кезеңде осы ДНК, молекуласының екі типін жалғап будан молекулалы синтезделген геномы бар векторлык. плазмида алады. ДНҚ тізбегінің үзілген жерлерін лигазаның көмегімен жалғайды. Бұл баяндалған жағдайда векторлык.плазмидаға қандай ген енгізілгені белгілі. Бірақ трансгеноз жұмыстарында көбінесе көптеген ДНҚ фрагменттері пайданылады, ал солардың ішінде бірлі-жарымында ғана «керек» ген болады. Осыған байланысты ген инженериясында кажет гені бар ДНҚ фрагменттерін табу және оны бөліп алу әдісінің маңызы өте зор. Осы керек гені бар ДНҚ бөлшегін алу үшін «бытыра мылтық» деп аталатын тәсіл колданылады. Оның мәні мынада: ДНҚ ферменттер аркылы көптеген ұсақ бөлшектерге бытыратылады, содан кейін соқыр тәуекелмен оны вектордың ДНҚ молекуласымен будандастырады. Осының алдында векторлық ДНҚ-ны желі түріне келтіру үшін және жабысқақ ұштар пайда болу үшін рестриктазамен өңдейді. Ішек таяқшасына рекомбинантты молекуланы кіргізгеннен соң, сұрыптайтын қоректік ортаның көмегімен қажетті гені бар ДНҚ бөлшектері түскен бактерияларды бөліп алады. Кірген генді оның шығаратын заты (фермент, гормон т.б.) арқылы тауып алады. Бактериялар көбейгенде онын құрамындағы рекомбинантты ДНҚ еселенеді де ДНҚ өркендері (клондары) пайда болады.
Матрицалық Рнк негізінде оған комплементарлы қос тізхбекті ДНК синтездеуді гибридтелу деп аталады. Бұл кері транскрипция процесі арқасында мүмкін болады. Ең алдымен м РНК- ның поли А ұшын праймермен гибридтейді. Праймер бұл жерде олигодезоксириботимидиннің қысқа тізбегі болып табылады. Ол бос күйіндегі 3 ΄ ұшты қалыптастыру үшін және кері транскриптаза ферменті жұмысты бастау үшін комплементарлы жұптастыра отырып 5′→3′ бағытында ДНК молекуласын синтездейді реакция өнімі ДНК тізбегімен комплементарлы жұптасқан РНК матрица тізбегінен тұратын гибритті молекула . In Vitro жағдайларында бұл процесті жүргізгенде жалғыз практикалық қиыншылық бар. Кері транскриптаза ферменті м РНК – ның 5′ ұшына жетпей кез- келген нүктеде тоқтап қалуы мүмкін . Ал м РНК – ның 5′ ұшына жетсе , фермент синтезделетін ДНК- ның ұшында тұзақ түзеді . Яғни түзілген ДНК- ның 3′ ұшында10-20 нуклеотид жұбынан тұратын иілім пайда болады . Осы кезеңде м РНК матрицаны сілтімен өңдеу арқылы ыдыратады. Нәтижесінде мРНК –ға комплементарлы 1 тізбекті ДНК түзілуі . Оны к ДНК деп атайды . Олардың 3′ ұшындағы иілім ДНК полимераза бір ферменті үшін праймер болып табылады. ДНК полимераза бір ДНК –ны комплементар тізбек синтездеу арқылы қос тізбекті ДНК-ға айналады. Реакция өнімі ұшында иілім бар 2 тізбекті ДНК молекууласы иілімді нуклеовза
S1 ферменті арқылы кесіп, кәдімгі екі тізбекті ДНК алады. Оны ары қарай синтетикалық геннің көп мөлшерін алу үшін клоундауға болады. Мұндай клонды кДНК клоны деп атайды. Клондау техникасы генетикалық материалдардан жеке гендерді тікелей алуға көп қолданылады.Әрбір жеке ген эукариоттарының геномының өте азғантай бөлігі болып табылады. Мысалы: сүтқоректілердің геномының мөлшері 109 нуклеотид жұбын құрайды.Ал орташа гендер шамамен 5 мың нуклеотид жұбтарынан тұрады, яғни ядродан РНК-ның 0,0005 осындай болар болмас материалды идентификациялау үшін арнайы заттар пайдаланады. Яғни бұл әдісте таңбаланған радиоактивті РНК немес ДНК заттар пайдаланады. Бұл кезде туындайтын қиындық арнайы белокқа сәйкес келетін мРНК алу бұл үшін арнайы әдіс “Гибрид тұншықтыратын трансляция әдісі пайдаланады” Бұл әдістің негізінде кДНК –ның м РНК-ның гибридтеліп, оның трансляциясына кеергі келтіру, қасиеті жатады. Бұрынғы уақыттарда гендерді бөліп алуда мРНК пайдаланған, Ал қазіргі уақытта химиялық тұрақты кДНК пайдаланады. ДНК-ны бір тізбекті фрагменттенрге денатурациялап, одан соң түзілген фрагменттерді фильтрге ауыстырады. Сол кезде олар имобилизацияланады. Бұл сарғыш қағазбен, су сіңіруге ұқсайды. Осы әдісті ойлап тапқан ғалымдардың атымен Саузерн блоттинг деп аталады. Нитроцелилозамен имобилизацияланған фрагменттерді радиоактивті зондпен In Vitro жағдайларында гибридтеуге болады. Бұл жағдайда әдіс Нозерн Блотинг деп аталады.
Бүкіл геномдардың ДНК-рын клондауды Шотган эксперимент деп атайды.Бұл үшін геномды қолайлы фрагменттерге бөледі.Одан соң фрагменттерді клондалатын векторға тіркесіп, химералық векторлар алады. Осындай фрагменттер жинағын геном библиотекасы деп атайды. Осындай жолмен алынған бактериофагтардың немесе плазмидалық векторды шексіз ұзақ уақыт сақтауға болады. Осы белоктардан бір-бірін клонды селекциялап, іріктеп алу үшін гибридтеу әдісі қолданылады.