Осыдан алыс емес уақыттарда ,бар болғаны 70-жылдардың басында биохимиктер ДНК-ны клетканың ең зертелуі қиын компоненті деп есептеді.. Нуклеотидтардың төтенше ұзын, химиялық бір дауысты жүйелілігін тұқым қуалаушылық материалда тек жанама әдістердің — немесе құрылымды анықтай , немесе генетиқалық талдау арқасында мүмкін болды.
Осы шақта жағдай аса өзгерді.
Егер де ертеректе ДНК талдауы биологиялық молекулалардың құрылым зерттеушілеріне қиын мәселе болса, қазіргі уақытта , ДНК алғашқы құрылымдары талдаудың жаңа әдістері енгізілген кезде ерекше еңбекті талап етпейді.
Қазіргі уақытта ДНК-ның жеке учаскелерін қырқып алуға, оларды практика жүзінде шексіз мөлшерде алуға ,және нуклеотидтер кезектілігін күніне бірнеше жүз нуклеотид жылдамдықпен анықтауға болады..
Дәл осы әдістердің көмегімен экспериментатордың қалауы бойынша бөліп алынған генді өзгертуге және оны клетка дақылдарының геномына немесе жануар эмбрионына болады .Бұл жерде өзгерген ген қызмет ете бастайды.
Рекомбинанты ДНК технологиясы зерттеушілерге бұрын шешуге қиын мәселелерді шешу жолында бүкіл клеткалық биологияға әсер етті .Мысалы көптеген жаңадан ашылған белоктар мен жеке домендердің қызметін анықталды,эукариоттарда гендердің экспрессия механизмдерінің реттелу принциптері ашылды. Гендік инженерия әдістерінің көмегімен клетка пролиферациясы мен дамуды реттеуге қатысатын көптеген белоктарды үлкен мөлшерде алуға мүмкіндіктер ашылды.Осы әдістерді пайдалану бұрындары көп күш рен қаржы жұмсауды талап ететін белок табиғатты гормондар мен жасанды вакциналарды үлкен көлемде өндіруде табыстар әкелуі сөзсіз.. Т Рекомбинанты ДНК технологиясына көптеген әдістер :өзінің жаңа ,сонымен бірге басқа ғылымдардан да, мысалымикроорганизмдер генетикасынан алынған әдістер кіреді.
Олардың ішіндегі аса маңыздыларына мыналар жатады:
1)ДНК –ны арнайы рестрикциялаушы нуклеазалармен қырқу ,соның арқасында әртүрлі гендерді бөліп алу және олармен манипуляциялау жылдамдайды
2)ДНК –ның тазартылған фрагментінденуклеотидтерді жылдамсеквенирлеу ,соның арқасында әртүрлі гендердің нақты шекараларын анықтап олар коделейтін амин қышқылдық кезектілікті анықтауға болады.
3) Нуклеин қышқылдарын гибридтеу, соның арқасында РНК немесе ДНК-ның арнайы кезектілігін олардың комплементарлы кезектіліктермен байланысу қасиетіне сүйеніп үлкен дәлдікпен және сезімталдықпен анықтауға болады.
Рестрикциялы нуклеазалар ДНК-ны нуклеотид кезектілігінің арнайы учаскелерінде ғана қырқуға қабілетті болады.
Клеткаға еніп, одан соң трансформациялана алатын бөтен ДНК молекулаларынан қорғану үшін , көптеген бактериялар бөтен ДНК-ны жоя алатын рестрикциялы нуклеазалар ферменттерін жасап шығарады.Әрбір осындай фермент ДНК-дағы 4-6 нуклеотидтен тұратын арнайы кезектілікті таниды.Бактериялардың өздерінің геномындағы осындай кезектіліктер А мен С қалдықтарын метилдеу жолымен жасырылып қойылған болады,ал кез келген клеткаға енген бөтен ДНК молекулалары нуклеазамен дереу танылып оның екі тізбегі де нуклеазамен қырқылады.
Әр түрлі бактерия түрлерінен көптеген рестрикциялы нуклеазалар бөлініп алынған.Қазіргі уақытта әр түрлі фирмалар 100-ден астам осындай ферменттер өндіреді, олар нуклеотидтердің әр түрлі кезектіліктерін таниды. Жеке рестрикциялы нуклеаза ДНК екі жақты спиралін кез келген ұзындықта әр түрлі фрагменттерге бөліп тастайды. Ол фрагментерді рестрикциялық фрагменттер немесе рестрикт деп атайды. Әр түрлі ДНК фрагменттерін анализдей отырып рестрикциялық карта құрастырады онда әрбір рестрикция сайтының басқа рестрикция учаскелеріне қатысты орны көрсетіледі
ДНК –ны клондау кез келген ДНК кезектілігін үлкен мөлшерде алуға мүмкіндік береді
Көптеген рестрикциялы нуклеазалар ДНК қос тізбегіне бірнеше нуклеотид айырмасымен кесінділер жасайды ,нәтижесінде фрагмент шеттерінде қысқа бір тізбекті учаскелер қалып қояды. Бұл қысқа бір тізбекті учаскелер басқа қысқа бір тізбекті учаскелердің негіздерімен комплементарлы жұптар түзуге қабілетті ,сондықтан олар жабысқақ ұштар деп аталады.
Рестрикциялы нуклеазалар арқылы түзілген жабысқақ ұштар ДНК кез келген екі фрагменттерін егер де олар дәл сол рестрикциялы нуклеазалар арқылы үзілген болса жамауға мүмкіндік береді. Демек кез келген ДНК фрагментін плазмида немесе бактеиофаг сияқты авторепликацияланатын генетикалық элемент құрамына енгізуге болады. Осындай фрагменті бар бактериалық клонды осы ДНК фрагментін өндіретін фабрикамен салыстыруға болады. Осындай жолдармен ДНК молекулаларын көбейтуді ДНК –ны клондау деп атайды.
ДНҚ-ның нуклеотидтік тізбегін анықтау
Қосспиралді ДНК өлшемдері бір макромолекулаға келетін нуклеотид жұбы (н.ж.) арқылы сипатталады. Клеткалық немесе вирустық ДНК үшін олар үлкен шамада айырмашылығы болады Мысалы,аса көп зерттелген бактериалық плазмидалар көптеген вирус және бактериофаг ДНК-лары бірнеше мың нуклеотид жұбынан (н.ж.) тұрады.Бактериялардың жыныс факторлары, митохондрилар және хлоропласт ДНК-сы бірнеше жүз нуклеотид жұбынан (н.ж.) тұрады . Бактериялардың хромосомдары—бірнеше миллион нуклеотид жұбы (н.ж.), ашытқылапр хромосомдары шамамен 107 нуклеотид жұбын (н.ж.) құрайды.Адам жиынтық хромосомаларының ДНК ұзындығы 3-109 нуклеотид жұбын (н.ж.) құрайды
ДНК-ның нуклеотид кезектілігін анықтайтын заманауи әдістер бір ғана экспериментте 150—300 нуклеотид қалдықтарынан тұратын фрагменттерді секвенирлеуге {ағылш. sequence — кезектілік) мүмкіндік береді.Сондықтан Поэтому ДНК-ның бастапқы молекуласы алдын ала фрагменттеледі.Олүшін көбінесе ДНК-ны рестриктазалармен гидролиздейді.
Бұл фрагменттердің нуклеотид кезектілігін анықтаған соң бүкіл ДНК-ның бірінші реттік құрылымын анықтауға мүмкіндік береді.
ДНҚ-ның нуклеотидтік тізбегін анықтаудың екі принципті айырмашылығы бар әдістері бар.Оның біріншісін А. Максам мен У. Гилберт ұсынған .Ол полинуклеотид тізбекті арнайы химиялық ыдыратуға негізделген. ДНК -ны Максама —Гилберт әдісі бойынша секвенирлегендегі операциялардың реті жалпы түрде мына суретте көрсетілген.
Бұл әдістің негізгі принциптері мынадай:
- Радиоактивті таңба енгізілген ДНК фрагментінің ұшы гомогенді болуы керек.
2.Анализделетін ДНК тізбегінің үлгісі 4 бірдей порцияға бөлінеді,және химиялық модификация жағдайлары осы 4 порцияның әрқайсысында реакцияға бір немесе екі пурин немесе пиримидин негіздерінің біреуі ғана қатысатындай етіп таңдалады; пуриндік негіздерді N7-aтом бойынша диметилсульфатпен метилдейді, пиримидинді негіздерді гидразинмен өңдеу арқылы ыдыратады; химиялық реагенттермен өңдеу екі жағдайда да модифицирленген мономерлі звеноның түзілуіне әкеледі,оны полинуклеотид тізбектен бөліп алуға болады.
- Химиялық модификация шектелген жағдайларда жүргізіледі..
- Негіздерді бір нуклеотид қалдығна дейін дәлдікпен анықтауға болады.
5 Фрагменттердің ұзындықтарын жоғары сезімтал полиакриламид гелінің жұқа қабатындағы электрофорез әдісі арқылы анықтайды. Электрофорез жоғары температурада 7 М мочевина бар буферлік жүйеде жүргізілгендіктен фрагментердің екінші реттік құрылымы бұзылады
Екінші әдісті Ф. Сэнгер әріптестерімен жасаған .Оның негізінде ДНК-полимеразалық реакция жатыр.Әдістің принципі суретте көрсетілген
Қазіргі уақытта Максам – Гилберт және Сэнгер әдісі сияқты әр түрлі әдістер бар және оларды толық автоматтандыруға сәті түсті . Дәл осылай, мысалы, ДНК секвенирлеу үшін праймердің 5′- ұшына соңына флоуресценциялық таңбаларды енгізеді, және де әрбір талданатын нуклеотидтардың төртеуінің әртүрлі спектрлік мінездемелерін анықтауда флоуресценциялаушы агенттерді қолданылады. Барлық биохимиялық операциялар роботпен өткізіледі.
ДНК толық нуклеотидті жүйелілігін анықтауда автоматтардың қолдануы принципті түрде кез келген организм геномын адамның геномын да анықтауға мүмкіндік береді.