1.Трансгенді жануарларды алу әдістері
2.Трансгеноз
3.Трансгенді тышқан алу тәжірибесі
1.Геномында бөтен ген (немесе гендер) бар жануарлар трансгенді (немесе трансформацияланған) деп аталады. Трансгенді жануарлар алу трансгеноз әдісі арқылы іске асады. Трансгеноз деп генді бір биологиялық жүйеден басқа жүйеге жаңа белгілері бар организмнің жаңа формасын алу үшін жасанды жолмен тасымалдауды түсінеді. Трансгенді жануарлар әр түрлі биологиялық активті биотехнологиялық заттарды синтездеу және бағалы белгілері (тұқымдылығы және өсу қарқындылығы жоғары, вирустық ауруларға төзімді т. б.) бар малдардың, жаңа тұқымдарын алу үшін қолданылуы мүмкін.
2. Трансгеноз әдісімен бөтен генді эукариоттық жыныс клеткаға енгізіп, оның жұмысын бақылау арқылы генетикалық инженерияның көптеген іргелі мәселелерін айқындауға болады, өйткені мұнда трансгенді эмбрионның жатырдағы даму ерекшеліктерін зерттеу мүмкін болады. Бұдан басқа ген жұмысы механизмдерінің түр ерекшелік дәрежесін айқындауға болады. Тасымалданған гендер (трансгендер) жаңа иесінің генетикалық аппаратымен құрылымды әрі функциялы байланысқандықтан бұл процесс in vitro жағдайындағы генетикалық рекомбинацияға әкеледі, ал бөтен гендерді, тасымалдау тәсілдері клетка және организмдердің генетикалық инженериясының әдістері болып саналады. Басқа жағынан, трансгенді жануарларды алу бойынша жүргізілген ғылыми іргелі зерттеулер мен олардың нәтижелерінің іс жүзінде қолданылуы арасындағы алшақтық соншалықты емес, демек, осы бағыттағы зертханалық жұмыстарды тек таза теориялық деп қарауға болмайды.
Трансгенді жануарларды алу үшін рекомбинатты гендерді микротүтікше және микрокапиллярлар көмегімен ұрықтанған ооциттің (жұмыртқа клетканың) пронуклеусіне енгізу әдісі кең қолданылады. Трансгеноз әдісі арқылы трансгенді тышқандар алу жақсы зерттелген. Мұның басты себебі болып тышқан ооциттері цитоплазмасының мөлдір болуы саналады. Басқа жануарлардың, соның ішінде малдың ооциттері мөлдір емес, сондықтан рекомбинантты ДНҚ-ны пронуклеуске енгізу өте күрделі және қиын іс. Осыған қарамай, соңғы кезде әр түрлі әдістемелік және техникалық жетілдірулер арқасында трансгенді қой, сиыр, шошқа және қоян алу іске асты (Хаммер және т. б., 1985; Крамер және т. б., 1986; Чёч, 1987).
Трансгеноз жұмысы көп жақты және бірнеше сатылардан тұрады. Алдымен, екі пронуклеус (аталық және аналық) сатысындағы зиготаларды алу керек. Бұл үшін синхронды овуляция, уақтылы қолдан ұрықтау немесе шағылыстыру керек, осыдан кейін белгілі уақыт өткеннен кейін зиготаларды хирургиялық жолмен алуға болады. Алынған зиготаларға бөтен ДНҚ-ны енгізбестен бұрын, оны іn vitro жағдайында әр түрлі әдістер мен тәсілдер арқылы сақтау керек. Енгізу кезінде зиготалар вазелин майының астындағы арнайы ерітіндінің тамшысына орналасады, бұл сұйықтықтың кеуіп кетуінен сақтайды. ДНҚ-ны зиготаға енгізу үшін диаметрі 0,5 — 2 мкм аралығындағы шыныдан дайындалған микротүтікшелер қолданылады.
Микротүтікшенің кемегімен 0,5 секундтан 2 минут аралығында ең аз дегенде 10-11 мл ДНҚ-ны зиготаға микроскоптан бақылап енгізеді. Микроинъекциялау процесі зиготалар үшін зақымды, сондықтан олардың біраз мөлшері жойылып кетеді. Микроинъекциядан кейін 2 сағатқа жетпей жарамды зиготаларды (трансгенді) алдынн ала, арнайы дайындалған аналық — реципиенттерге тасымалдайды. Бұл кезеңде де зиготалардың көп мөлшері зақымданады. Аяғында, трансгенді жануарлардың шығуы 1%-ке тең болады. Алайда, мұның өзі трансформация және трансдукциямен салыстырғанда өте жоғары көрсеткіш болып саналады. Қазіргі кезде трансгеноз әдісі көптеген ғылыми зерттеулерде қолдану алды.
1980 ж. Ф. Раддел және оның қызметтестері алғаш рет герпес вирусының тимидинкиназа генін тышқан клеткасының геномына енгізе алды. Трансгеноз нәтижесіндо алынған жеті тышқанның төртеуі ТК гені бойынша трансгенді болып шықты.
Трансгенді тышқандарды алу бойынша кейінжүргізілген көптеген зерттеулер оның тиімділігі әр түрлі факторларға байланысты екендігін дәлелдейді. Рекомбинантты генді аталық пронуклеуске енгізу процесіндетрансгенді жануарлар жиі шығатыны белгілі болды. (Р. Бринстер және т. б., 1985, К. Гордон, Ф. Раддел, 1984). Бұдан басқа олардың пайда болу жиілігі ДНҚ-ның үшінші құрылымына және оның мөлшеріне (түзу формалыДНҚ-ның көп мөлшерін қолданғанда трансформация дәрежесі жоғарылайды) байланысты Р. Пальмитер және т. б., 1984; Т. Вагнер және т. б., 1986.
Бөтен геннің иесінің ДНҚ-сымен байланысу сипатын зерттеу үлкенпроблема болып саналады.Трансгеннің клетка ДНҚ-сымен байланысатын белгілі орыны болуы керек, алайда, көптеген зерттеулер оныңхромосоманың әр түрлі бөліктерімен байланысатынын дәлелдейді.Бұл процестің механизмі әзірше толық түсінікті емес. Дегенмен осыған орай трансген экспрессиясының әр қилы өтуі бұл проблеманы терең зерттеуді қажет етеді. Трансгеннің иесінің геномымен байланысуы кездейсоқ жүретін болса, онда ол хромосоманың гетерохроматинді бөліктеріне еніп, инактивацияланып кетеді. Бұдан бөлек хромосома бөлігімен байланысқантрансгенніңактивтілігіклеткалық ДНҚ-ның реттеуші элементтері-промотор, энхансер және силансерлерге байланысты болуы да мүмкін.
3.Трансгенді жануарларды алудың қолданбалы зерттеулерінің бағыттары үшін егеуқұйрықтың соматотропип генін тышқанның геномына енгізу Р. Пальмитер(1982) тәжірибесінің маңызы өте зор. Егеуқүйрықтың соматотропин генінің клондарын ген инженериясы әдісі көмегімен бактерия клеткасынан алуға болады. Алайда, мұндай генді тышқан клеткасынаенгізу үшін оныңбактериялық промоторын эукариоттық реттеуіш элементтерімен ауыстыру қажет. Осы мақсатпен Р. Пальмитертышқанның ДНҚ- сынан металтионеин генінің промотор бөлігін бөліп алды. Бұл геннің синтезііn vivo жағдайында ауырметалдардыңиондары (Zn, Сd) арқылы қозады.Микроинъекциялау үшін егеуқұйрықтың өсу гормонының құрылымды генінен және металтионеин промоторынан құрастырылған рекомбинантты ДНҚ қолданылды. Зерттеуші лер осындай рекомбинантты ДНҚ-ның 600 көшірмесін әрбір зиготаның аталық пронуклеусіне енгізді. Нәтижесінде 21 ұрпақ алынды, оның 7-інде егеуқұйрықтың гені байқалды. Трансгенді тышқандардың азығына мырыш тұзын —ZnSО4 қосқанда, олардың геномындағы бөтен геннің функциясы іске асты. Мұндай тышқандардың қанын талдау оларда өсу гормонының мөлшері қалыпты жағдайдағыдан 100—800 өсе жоғары екендігін көрсетті. Гормон мөлшерінің жоғарылауы ген көшірмелері санының артуына байланысты болды. Гормонның артық мөлшерінің синтезделуі тышқан салмағының 1,8 есе артуына әкелді. Мұндай трансгенді жануарды алып тышқан деп атайды. Кейін жүргізілген зерттеулер Р. Пальмитер тәжірибесінің нәтижесін әр қилы деңгейлерде дәлелдеді. Неміс ғалымы Г. Брэм (1986) тәжірибесінде алынған трансгенді тышқандардың салмағы бақылау тобындағы тышқандардан 1,51—2,36 есе ауыр екендігін көрсетті. Бірқатар зерттеулер (Е. Вагнер және т. б., 1985; Р., Бринстер, 1985; А. Дыбман, С. Гордецкий, 1987 т. б.) адамның соматотропин т. б. гормондар генін тышқандарға енгізіп, трансгенді ұрпақ алу мүмкіндігін дәлелдеді.
Трансгенді тышқан алу тәжірибелерінің нәтижелері осындай зерттеулердің мал шаруашылығында жаңа биотехнологиялық бағыттарды жетілдіру үшін үлкен болашағы бар екендігін көрсетеді.
Шотландия генетиктері Дж. Кларк және т.б. француз биологтарымен бірігіп, қой сүтінің — лактоглобулин белогы генін микроинъекциялау арқылы трансгенді тышқандар ала алды. Мұндай тышқандардың сүт бездерінде жаңа белоктың синтезделуі өтіп, сүттің сапасы өзгерді. АҚШ-та жануарлар биотехнологиясы саласының белгілі маманы Катерина Гордон сүт бездерінде бағалы медициналық препарат — адамның плазминоген белогы синтезделетін трансгенді тышқандар алды. Қазіргі кезде трансгенді тышқандар зертханада іргелі ғылыми зерттеулерге үлкен үлес қосуда. Алайда, оларды биотехнологиялық өнімдер өндіру мақсаты үшін қолданудың белгілі қиындықтары бар. Сондықтан 1985 жылдан бастап, трансгенді мал алуда көптеген ғылыми жұмыстар жүруде.
Трансгенді малдарды алу зерттеулерінде тышқандардың трансгеноз әдісінің үлгісі икемделіп, қолдану алды. Жалпы трансгенді малдарды алу бірінің артынан бірі өтетін мынадай кезеңдерден тұрады.
1) рекомбинантты ДНҚ молекуласын құрастыру және оның клонын алу;
2)трансгенозаға жарамды зиготалар алу және олардың пронуклеустерін айқындау;
3)рекомбинантты ДНҚ көшірмелерінің белгілімөлшерін зиготалар пронуклеустеріне (мүмкіндігіншеаталық) микротүтікше арқылы енгізу;
4)зиготаларды гормондық дайындықтан өткенаналықтардың жыныс жолдарына тасымалдау;
5) туылған малдардың генотип және фенотипі бойынша бағалап, трансгенді екендігін анықтау бөтен геннің клетка ДҢҚ-сымен байланысуын, рекомбинантты ДНҚ-ның экспрессиясын, ген өнімінің синтезделуін анықтау;
6)трансгенді малдардыңжаңа қасиетініңұрпаққа тұқым қуалайтын бақылау.
Зертханадағы жануарларға қарағанда малдар зиготасының пронуклеустерін микроскоптан көру өте қиын, өйткені ұрықтанған малдың аналық жыныс клеткасында әр түрлі майлар мен пигменттердің болуы зиготаны көмескі етеді. Сондықтан генді микротүтікшемен тікелей пронуклеуске енгізу қиындық туғызады. Бұл қиындық трансгенді малдар алу жиілігіне үлкен әсер өтеді, өйткені пронуклеускемикроинъекциялау арқылы ғанабарлық ұрпақтың 20—30%-тін трансгенді ете алады. Қазіргі кезде бұл қиындықты болдырмайтын бірнеше тәсілдер зерттелуде (Д. Крамер және т. б., 1986). Осы бағытта контрасты микроскоп, центрифуга немесе флуоресценттік бояуларды қолдану пронуклеустерді айқындау үшін үлкен көмегін тигізді.
Трансгеноз әдісі ауыл шаруашылық малдары ішінен алдымен қойда айтарлықтай ғылыми нәтиже берді. Австралия ғалымдары зиготаға өсу гормоны генін микроинъекциялау арқылы әлемде алғаш рет трансгенді қойлар алды (Т. Скотт, 1986). Зерттеушілер тәжірибедетышқанның металтионеин промоторын қойдың өсу гормонының құрылымды генімен біріктірді. Бес аптадан кейін трансгенді қозыларға мырыштың болмашы мөлшерін енгізгенде рекомбинантты ДНҚ тізбегінің реттеуші бөлігі яғни промоторы активтеліп, соматотропин генінің интенсивті синтезі іске асты. Осының нәтижесінде 2—4 жылдан кейін трансгенді қойлар өздерінің тірі салмағы бойынша құрдастарынан 1,5 есе асып түсті. Қазіргі уақытта Австралия ғалымдары құрамында күкірт бар амин қышқылдарының синтезделуіне жауаптыекі ферментті коделейтінжаңа гендерді қойларға енгізу жұмысын жүргізуде.
Бишоф бастаған зерттеушілер тобы адам қанының ұю факторын трансгенді қойлардың сүтінен алупроектісін , іске асыру үшін қызу ғылыми жұмыстар жүргізуде. Олар қой геномына қан ұюының IX факторының генін қойдың — лактоглобулин промоторымен біріктіріп, енгізу мақсатын алға қойды. Ұю факторы қойдың сүт бездерінде синтезделіп, сүтке бөлінеді деп күтілуде. Зерттеу жұмысының бас кезінде қойдыңлактоглобулин белогытышқанның сүт бездерінде синтезделіп, сүтке бөлінді. Келесіэксперименттерде Дж. Симонс және т. б.— лактоглобулин генінің бірінші экзонының аймағына адам қаны ұюының IX факторының генін жалғап, рекомбинантты ДНҚқұрастырды. Осы конструкцияны зиготаларғамикроинъекциялау арқылы трансгенді қойлар алынды. Рестрикциялық талдаудың мәліметтері бойынша трансген толық бағалы болғанымен, ол өз функциясын іске асырмады. Казіргі кезде зерттеушілер оның себебін анықтап, алга қойған мақсаттарын жақын арада шешеді деп күтілуде. Шотландия генетиктері сүтіндеадамның антитрипсин а— 1 белогы бар трансгенді қойларды алды. Бұл қосылыстың 1 л. сүттегі мөлшері 35 г. тең болды. Медицинада оны өкпе ауруларын емдеу үшін қолданады. АҚШ ғалымдары трансгенді ешкілердің 1 л. сүтінеп адам қанының тромбларын
ыдырататын плазминогеннің 3 г. ала алды(Р. Селтзер,1992).
Болашақтағы ғылыми жобаларда қойдың, сиырдың немесе ешкі мен мегежіннің сүт бездерінен (немесе қанынан) интерферон, инсулин сияқты өте құнды дәрі-дәрмек алу жолдарын ойластыруда. Бұл мәселелер тышқандарда белгілі деңгейде шешімін табуда.
Трансгенді шошқаларды алудың өзіндік қиындығы бар, өйткені мегежін зиготаларының пронуклеустерін тіпті контрасты микроскоптың өзінен көру мүмкін болмайды. Оларды центрифугалау арқылы Г. Хаммер (1980) және Г. Брэм (1986) зертханада трансгенді шошқалар алынды. Р. Хаммер өзінің қызметкерлерімен адамның соматотропин генін (промотор бөлігі металтионеин – 1 генінен) 316 зиготаларға және 1719 қос клеткалы эмбриондарға микроинъекциялады. Оларды реципиент-мегежіндерге тасымалдап, 192 торай алды, олардың 20-сы трансгенді болып табылды. Трансгенді торайлардың 11-інде бөтен геннің қызметі байқалды, яғни олардың қанында адамның өсу гормонының көп мөлшері синтезделді. Г. Брэм зертханасында осы генді зиготалардың пронуклеустеріне инъекцияланғаннан кейін реципиенттерге 208 зигота тасымалданды. Алынған 7 торайдың біреуі трансгенді болып шықты.
Жыл сайын трансгенді малдарды алу ғылыми жұмыстары үдей түсуде. Қазіргі кезде әр түрлі ғылыми лабораторияларда трансгенді ірі қара мал (Дж. Лохс және т. б., 1980; Д. Крамер және т. б., 1980), қоян (Р. Хаммер және т. б., 1985; Л. К. Эрнест және т. б., 1989) және балықтар (Д. Пауэрс, 1986) алынды. Трансгенді ірі қара алу қиындығы биологиялық және экономикалық себептерге байланысты. Басқа малдарға қарағанда сиырлардан биологиялық жарамды зиготалардың жеткілікті мөлшерін алу проблемасы әлі толық шешілген жоқ. Екінші жағынан генетикалық бағалы донор — сиырлардан ұрықтанған жыныс клетканы алу олардың кәбею функциясының төмендеумен байланысты.
Сонымен, жоғарыда келтірілген мәліметтер трансгенді малдарды алу осы заманғы биотехнологияның келешек бағыты екендігін көрсетеді, ал оның негізгі мақсаты — малдың генотипін жаңадан құрастырып, олардан адам үшін бағалы өнім өндіру. Мұны іске асыру үшін қажет генді идентификациялау, бөлу және клонын алу, оларды зиготаларға ендіріп, экспрессиясын қосу және бөтен геннің ұрпаққа тұқым қуалауын шешу керек. Осы мәселелерді генетикалық инженерия әдістерімен шешу жоғары тиімді биотехнологияның малдар селекциясында қолдануының жаңа мүмкіндіктерін ашады. Оның іске асуы, ең алдымен, мал генетикасының молекулалық негіздерін іргелі зерттеуіне байланысты.
Қолданылатын әдебиеттер тізімі.
Негізгі әдебиеттер:
1.Б.Бегімқұлов Молекулалық генетика және биотехнология негіздері. Алматы, «Білім» 1996.
2.Дж.Уотсон, Дж.Туз,Д.Курц.Рекомбинантные ДНК.М.Мир, 1986г.
3.А.Сассон Биотехнология:свершения и надеждыМосква “Мир” 1987 г.
4.Маниатс Т.Фрич Э.Дж.Сэмбрук. Методы генетической инженерии.Молекулярное клонирование.М.Мир 1984г.
5.Инге-Вечтомов С.Г.Введение в молекулярную генетику.М.Высшая школа,1983г.
Қосымша әдебиеттер:
6.Новое вклонировании ДНК.Методы / Под ред. Д.Гловера.М.Мир, 1989г.
7.Льюин Б.Гены.М.Мир, 1987г.
8.Мобильность генома растений /Под ред.Б.Хон и Е.С. Деннис.М.Во “Агропромиздат” ,1990г
9.Пирузян Э.С. Основы генетической инженерии растений.М Наука,1988г.
10.Созинов А.А. Ақуыздың полиморфизмі және оның генетика мен селекциядағы маңызы. М. Наука. 1985 ж. 272 бет.